劲骨胶囊鉴别及加水10mL溶解

④薄层色谱法

取胶囊内容物50mg于分液漏斗中，劲骨胶囊鉴别及加水10mL溶解，功效加石油醚（30～60⁰C）20mL，成分振摇，盐酸静置分层，氨基取下层液过滤，葡萄作为样品溶液；取盐酸氨基葡萄糖对照品10mg，糖含加水5mL溶解，量测作为对照品溶液；按样品配方和工艺制成不含盐酸氨基葡萄糖胶囊内容物50mg，劲骨胶囊鉴别及与样品同法制成阴性样品溶液。功效

取上述3种溶液各3～5μL，成分分别点于同一硅胶G薄板上，盐酸以正丁醇-乙醇-冰醋酸-水=（4:1:1:2，氨基V:V:V:V）为展开剂（按展开剂体积1mL加入1mg茚三酮，葡萄混匀），糖含展开，取出，晾干，60⁰C烘箱加热10min，至斑点显色清晰，在日光灯下检视。

（2）白芍提取物鉴别

取胶囊内容物2g，加乙醇40mL，超声提取20min，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加水20mL溶解，加水饱和正丁醇溶液振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇1mL溶解，作为样品溶液；取白芍对照提取物1g，加乙醇30mL，与样品同法制成对照提取物溶液；取白芍对照药材0.5g，加乙醇10mL，与样品同法制成对照药材溶液；取芍药苷对照品适量，加乙醇制成1mg/mL溶液，作为对照品溶液；按样品配方和工艺制成不含白芍及白芍提取物胶囊内容物2g，与样品同法制成阴性样品溶液。

取上述5种溶液各5～10μL分别点于同一硅胶G薄板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2，V:V:V:V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%（g/mL）香草醛硫酸溶液，65⁰C烘箱加热10min，至斑点显色清晰，在日光灯下检视。

（3）碳酸钙鉴别

①稀盐酸反应法

取胶囊内容物0.2g，于10mL试管中，作为样品；取对照品碳酸钙0.1g，于10mL试管中，作为对照品；按样品配方和工艺制成不含碳酸钙胶囊内容物0.2g，与样品同法制成阴性样品。在上述3支试管中分别滴入稀盐酸试液，观察反应。

②草酸铵试液沉淀法

取胶囊内容物2.5g，于坩埚中先炭化，转入600⁰C高温马弗炉中炽灼3～4h，残渣加15mL稀盐酸试液溶解，过滤至50mL具塞试管中，加1滴甲基红试液，用氨试液调至黄色，再加数滴稀盐酸试液使呈酸性，作为样品溶液；取碳酸钙对照品0.6g于50mL具塞试管中，加15mL稀盐酸试液溶解，与样品同法制成对照品溶液；按样品配方和工艺制成不含碳酸钙胶囊内容物2.5g，与样品同法制成阴性样品溶液。

在上述3支试管中分别滴加草酸铵试液，观察反应现象和颜色（稀盐酸、甲基红、氨试液、草酸铵试液参考中国药典四部配制）。

（4）维生素K1鉴别

取胶囊内容物2g，于三角瓶中，加0.03mol/L盐酸溶液5mL，60⁰C超声提取10min，加无水乙醇30mL，继续超声20min，取出，放至室温，转移至50mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，作为样品溶液；取维生素K1对照品适量，加无水乙醇溶解，制成2μg/mL，作为对照品溶液；按样品配方和工艺制成不含维生素K1胶囊内容物2g与样品同法制成阴性样品溶液。

将上述3种溶液用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱仪测定。

色谱柱C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相:甲醇100%；检测波长248nm；柱温30⁰C；进样量10μL。

（5）维生素D3鉴别

取胶囊内容物5g，于具塞试管中，加0.02%（mL/mL）氨水溶液10mL和无水乙醇25mL，60℃超声提取10min，取出，放至室温，吸取正己烷10mL于试管中，摇匀，倒入离心管中，3000r/min离心10min，取上层正己烷作为样品溶液；取维生素D3对照品适量，加正己烷溶解，制成0.8μg/mL，作为对照品溶液；按样品配方和工艺制成不含维生素D3胶囊内容物5g，与样品同法制成阴性样品溶液。

将上述3种溶液用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱仪测定。

色谱柱:硅胶柱（3.9mm×150mm，5μm）；流动相:正己烷-环己烷-异丙醇（50:50:0.8，V:V:V）；检测波长265nm:柱温:30℃；进样量:20μL。

（6）盐酸氨基葡萄糖含量测定

精密称取胶囊内容物20mg，于三角瓶中，先加1mL乙腈使样品湿润分散，再加适量水超声提取5min，取出，放至室温，转移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，作为样品溶液；精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品10mg，于25mL容量瓶中，先加1mL乙腈湿润分散，用水定容至刻度，摇匀，制成400μg/mL对照品溶液。

将上述2种溶液用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱仪测定。

色谱柱:C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相:乙腈-0.4%（mL/mL）磷酸（三乙胺调至pH3.0）（4:96，V:V）；检测波长:95nm；柱温30℃；进样量:10μL。

方法学验证:参照中国药典四部药品质量标准分析方法验证指导原则进行。

三、结果与分析

1、鉴别盐酸氨基葡萄糖

（1）碱性酒石酸铜反应法

取胶囊内容物200mg，于10mL试管中，加水5mL溶解，作为样品溶液；取盐酸氨基葡萄糖对照品0.1mg，与样品同法制成对照品溶液；按样品配方和工艺制成不含盐酸氨基葡萄糖胶囊内容物200mg，与样品同法制成阴性样品溶液的方法实验后观察，样品和对照品溶液生成红色Cu₂O沉淀，阴性样品溶液则无此反应，如图2所示。化学反应式如下:C₆H₁₂O₆+2Cu²⁺+4OH-=C₆H₁₂O₇+Cu₂O↓（红色）+2H₂O。

（2）硝酸银反应法

制法与碱性酒石酸铜反应法相同，在水溶解的3支试管中，加入数滴稀硝酸试液，使呈酸性，滴加硝酸银试液，观察反应颜色，样品和对照品溶液生成白色絮状AgCl沉淀，阴性样品溶液则无此反应，如图3所示。化学反应式如下:HCl+AgNO₃=AgCl↓（白色）+HNO₃。

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